Los alumnos de Biología y Geología de 1º de bachillerato de investigación, dedicaron la semana del 5 al 9 de marzo a experiencias de biotecnología en el laboratorio. Con la ayuda de dos kits, preparados por la empresa de biotecnología
Vita-Aidelos, se dedicaron dos sesiones prácticas a la extracción de ADN bacteriano y otras dos sesiones a la bioproducción de enzimas. Para ello, además de los kits, se utilizaron una estufa de cultivo y un baño termostático que fueron amablemente facilitados por la citada empresa.
Los kits didácticos de biotecnología preparados por Vita-Aidelos
para su uso en centros educativos.
Para la práctica de extracción de ADN bacteriano se procedió, en una primera sesión, a analizar los fundamentos de la práctica a realizar y el protocolo a seguir, con la ayuda de un DVD elaborado por Vita-Aidelos para guiar la práctica. Posteriormente, se procedió a la inoculación e incubación, a 37ºC en estufa de cultivo, de bacterias de la especie Citrobacter freundii. Gracias a que se disponía de dos kits, se pudo trabajar en dos equipos de 6 y 7 alumnos.
En una segunda sesión, tras conseguir que las bacterias se multiplicaran exponencialmente en un tubo de ensayo gracias a la estufa de cultivo, se añadieron sendas soluciones que permitieron la rotura (lisis) de la pared y la membrana bacterianas, tras lo cual el ADN de las mismas quedó libre. Por ser éste soluble en agua, para poder visualizarlo añadimos alcohol muy frío, lo cual produjo la inmediata precipitación del ácido nucleico. Ante la sorpresa de los estudiantes, madejas de ADN bacteriano se comenzaron a formar y distinguir en el interior de sus tubos de ensayo.
Añadiendo la solución de lisis 1, para romper la pared celular bacteriana (equipo 1).
El equipo 2 también añadió la solución de lisis 1, al tubo donde se habían cultivado las bacterias.
Los tubos fueron colocados en el baño termostático, 20 minutos a 37º, para
conseguir la lisis de la pared celular bacteriana.
Añadiendo la solución de lisis 2, que destruiría la membrana celular bacteriana.
Los tubos con la solución de lisis 2 (un tensioactivo aniónico),
se mantuvieron en el baño termostático a 60ºC.
Tras añadir la solución de precipitación (alcohol) muy frío, este fue el resultado de ambos equipos:
unas espectaculares fibras de ADN bacteriano.
Conclusión: hemos roto las envueltas bacterianas y hemos liberado el ADN hidrosoluble. Al añadir la solución de precipitación, lo hemos vuelto insoluble y nuestros ojos han podido contemplar la sustancia fundamental que determina las características genéticas de los organismos.
Una segunda práctica, también realizada en dos sesiones, consistió en la bioproducción de enzimas por parte de bacterias. En la primera sesión se inocularon dos líneas, A y B, de bacterias diferentes en distintos tubos de ensayo y placas de petri que contenían, cada uno, distintas sustancias que se pretendía lisar: almidón, celulosa, proteínas y ONPG (O-nitrofenil-galactósido, una sustacia similar a la lactosa). En la línea A se incubaron, en la estufa de cultivo, bacterias de la especie Bacillus subtilis. En la línea B, se incubaron bacterias de la especie Micrococcus luteus.
Los estudiantes se preparan para iniciar la segunda práctica. Se siguen las normas
en materia de seguridad, pues se va a trabajar con bacterias
Tras 48 horas de incubación a 37ºC, se fueron añadiendo sucesivamente a los distintos soportes en los que se cultivaban las bacterias, diferentes colorantes afines a las sustancias que se pretendía lisar: almidón, celulosa y ONPG. Si las bacterias habían producido enzimas de lisis (amilasas, celulasas y betagalactosidasa, respectivamente) estos colorantes no tendrían efecto. En el caso de las proteínas, lo que se hizo fue introducir los tubos de ensayo correspondientes en la nevera a 4ºC durante unos minutos. Si las bacterias habían producido enzimas proteasas, el medio seguiría líquido. En caso contrario, las proteínas, sin lisar, se volverían sólidas. En las siguiente imágenes vemos los resultados correspondientes a la producción de amilasas, celulasas y betagalactosidasa.
Tras añadir unas gotas de un reactivo yodado, que tiñe el almidón de negro, el tubo A, a la derecha,
se colorea de marrón (las amilasas han degradado el almidón), mientras que en el tubo B, a la izquierda,
el almidón sin degradar (no se han producido amilasas) se colorea de negro.
Añadimos un reactivo que tiñe de rojo la celulosa a los
tubos de ensayo que contenían este polisacárido.
Hacemos lo mismo en las placas de petri con celulosa.
Estos son los resultados: los tubos de ensayo de la línea A quedan de color naranja (la celulosa se ha degradado),
mientras que los de la linea B quedan rojos (las bacterias correspondientes no han producido celulasas).
En las placas de petri ocurre lo mismo que en los tubos de ensayo. Las A (arriba) quedan naranjas y las B (abajo) rojas.
En las pruebas con ONPG, en los tubos A se ha producido betagalactosidasa, que degrada el producto. Al añadir un reactivo específico se produce un color amarillo. En cambio, en el tubo de la línea B, este cambio de color no se produce: el ONPG se mantiene y no se desarrolla ningún color (no se ha producido betagalactosidasa).
Como conclusión, el microorganismo Bacillus subtilis, presente en los tubos y placas de la línea A, es productor de enzimas de distinto tipo: amilasas, celulasas, betagalactosidasa y proteasas, que pueden tener numerosas aplicaciones industriales: farmacología, industrias lácteas, fabricación de detergentes, industria alimentaria, etc. En cambio, el microorganismo de la línea B, Micrococcus luteus, no produce estos enzimas.
Queremos agradecer desde aquí, a la empresa
Vita-Aidelos, toda la ayuda y el soporte recibidos, así como su permanente disposición a resolver nuestras dudas durante el proceso.
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